李新华 刘恒方 杨期东 苗旺
环氧化物酶2(cyclooxygenase2,Cox2)及诱导型前列腺素合成酶1(membrane
associated prostaglandin E ,mPGES.1)从多个方面影响动脉粥样硬化(atherosclerosis,
AS)进程。本实验将采用超选择性Cox2抑制剂干预动脉粥样硬化性模型兔,检测模型兔冠状动脉的Cox2、mPGES1表达,探讨Cox2、
mPGES1诱导的炎性反应机制在冠状AS形成中作用。
1
材料和方法
1.1
动物和分组
新西兰雄性大白兔32只(由中南大学湘雅医学院实验动物中心提供);1%高胆固醇颗粒饲料由中南大学湘雅医学院实验动物中心配置;塞来昔布(辉瑞公司产)。32只新西兰大白兔,体重(2.0±0.22)kg,适应性喂养1周,随机分为4组,每组8只,
A组:正常对照组予以正常颗粒饲料喂养;模型分组如下:B组:无药物干预组;C组:小剂量塞来昔布干预组(15
mg/kg,2次/d);D组:大剂量塞来昔布干预组(35 mg/kg,2次/d),灌胃法给药4周。
1.2
方法
1.2.1
模型制作及组织取材
模型兔给于1%高胆固醇颗粒饲料喂养2周,给药至4周末(即高脂6周)处死动物,取出冠状动脉左主干,左前降支,左旋支及右冠状动脉,剥净动脉外膜的周围脂肪,平分为2等份,其中1份15%的中性甲醛固定,石蜡切片,HE染色,光镜观察组织学改变。另一份置入-196℃液氮中待测。病理学方法证实粥样硬化性冠状AS模型制作成功。
1.2.2
细胞总RNA的提取及RTPCR
冠状动脉组织按文献法提取总RNA,磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因作为内参照。采用TaKaRa One
Step RNA PCR Kit (AMV)公司的一步反应法完成RTPCR反应。Cox2的引物:上游:5′GGT GGA GAT GAT CTA CCC
GC3′;下游: 5′ GGT TGA AAA GCA GCT CTG GG 3′,产物片断151 bp;mPGES1引物5′ GCA GCG CAC
TGC TGG TTC TGA AGA 3′;下游: 5′AGA CCA GGC CCA GGA AGA GGA AA 3′,产物片断210
bp;GAPDH引物上游:5′ AGG GTC ATC ATC TCA GCC CC 3′;下游:5′ ATG CCT GCT TCA CCA CCT
TC 3′,445 bp;RTPCR反应条件: Cox2:逆转录反应50℃ 30 min,94℃预变性2 min,94℃变性35 s,55℃退火40
s,72 ℃延伸45 s,共35个循环,72 ℃终延伸10 min;mPGES1的RTPCR反应条件: RT反应50 ℃30 min,94 ℃预变性2
min,94 ℃变性30 s,55℃延伸45 s,72℃延伸45 s,共32个循环,72 ℃终延伸10 min。RTPCR反应体系均为25
μL。取PCR产物2 μL经1.0%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色, 应用美国Eagle
EyeII型凝胶图像软件分析系统进行定量分析,用目的基因的吸光度值与GAPDH吸光度的比值代表目的基因的相对表达含量。
1.2
冠状动脉组织Cox2及mPGES1 蛋白质表达
冠状动脉组织中加入三去污剂裂解缓冲液进行组织细胞裂解,于4℃、14 000
r/min离心30 min,弃除沉淀,lowry法进行蛋白定量,取50 μg蛋白加入2× SDS凝胶加样缓冲液中,在100℃加热10 min使蛋白质变性。用7%
SDS聚丙烯酞胺凝胶进行电泳分离,转PDVF膜,丽春红染色观察转移效果,并确定蛋白分子量标准位置。封闭液封闭2小时,按1:200加入一抗(均为
1:200稀释),4℃孵育过夜,TBST洗3次,1:2000加入辣根过氧化物酶标记兔抗羊二抗,室温孵育1
h,TBST洗3次,转移至X光胶片。结果用Labwork凝胶图像分析系统对胶片扫描,以目标蛋白面积灰度值与实验组进行比较和半定量分析。
1.3
统计学处理
应用SPSS12.0统计软件分析,半定量RTPCR和Western
blot结果采用方差分析,进一步两两比较采用q检验(StudentNewmanKeuls法)P<0.05为差异有统计学意义。
2
结果
2.1 冠状AS组织Cox2及mPGES1
mRNA的表达
与A组比较,B组冠状AS组织Cox2 mRNA和mPGES1 mRNA表达显著上调,差异有统计学意义(
P<0.01);与B组比较,C、D组明显下调,差异有统计学意义(P<0.05);与C组比较,D组下调差异无统计学意义(P>0.05);与A组比较,B
、C、D组Cox2及mPGES1 蛋白质表达水平上调,差异有统计学意义(P<0.05)。与B组比较,C、D组Cox2及mPGES1
蛋白质表达水平下调,差异有统计学意义(P<0.05);与C组比较,D组Cox2及mPGES1
蛋白质表达下调差异无统计学意义(P>0.05).
3
讨论
环氧化酶(cyclooxygenase,Cox)主要催化花生四烯酸转化为前列腺素G2(PGG2)和有生物活性的最终产物,譬如PGD2、PGE2、
PGF2、PGI2、TXA2等。在多数组织的生理状态下Cox2基因以极低拷贝数表达,只有当细胞接受相应的刺激时Cox2才开始大量表达。
mPGES1是PGE2合成的关键限速酶,与Cox2共同定位。近年来,研究[4]表明Cox2
及mPGES1与AS性疾病关系密切。有学者把AS本身也看作是一种炎症反应过程,认为炎症释放的细胞因子可诱导和表达Cox2/mPGES1,加速AS的进程并导致AS斑块的增大和脱落。免疫组化技术研究发现CAS斑块
mPGES1有强烈的免疫活性,症状性斑块的mPGES1的蛋白也为高水平表达。本实验A组仅检测到Cox2 mRNA与mPGES1
mRNA及其蛋白的微弱表达;B、C、D组冠状AS组织Cox2 mRNA与mPGES1
mRNA及蛋白表达水平有不同程度的上调。与空白对照组比较,尽管动物模型给予塞来昔布干预,但是Cox2 mRNA与mPGES1
mRNA及其蛋白仍呈高水平表达。表明冠状动脉发生AS改变后,其Cox2/mPGES1基因诱导的炎症机制在冠状AS的病理过程中可能起着重要的作用。
免疫组化技术研究证实AS早期阶段炎症反应刺激释放的细胞因子诱导Cox2/mPGES1大量表达,引起炎症反应的放大增强。超选择Cox2抑制剂通过降低血管炎症反应产生抗炎效果,有助于提高AS斑块的稳定性。有学者[1]给健康的受试者服用Cox2抑制剂后,发现有抗AS的作用。服用
Cox2抑制剂后有增加心血管事件风险的报道,可能为冠状动脉发生AS改变后诱发炎症的放大效应,导致心肌细胞的凋亡。本实验通过塞来昔布干预冠状AS
模型兔后发现Cox2 mRNA及mPGES1
mRNA表达水平下调,其蛋白表达水平也相应下调,表明塞来昔布可使冠状AS的Cox2/mPGES1表达水平下调。大剂量塞来昔布应用并未见 Cox2
mRNA与mPGES1
mRNA及蛋白表达水平呈现量效关系,暗示小剂量的超选择Cox2抑制剂的应用可间接降低冠状AS的炎性反应程度,延缓冠状AS损害的进程。